Hidrogel pegajoso a base de gelatina bioinspirada para diversas superficies en el cuidado de heridas por quemaduras

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 13735 (2022) Citar este artículo

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El tratamiento adecuado de las heridas por quemadura tiene en cuenta el cumplimiento del paciente y proporciona un entorno para acelerar el cierre de la herida. Los hidrogeles pegajosos son propicios para el tratamiento de heridas. Pueden actuar como un parche preventivo de infecciones con administración controlada de fármacos y adherencia superficial diversa. Una investigación basada en hipótesis explora una propiedad de polidopamina bioinspirada en un hidrogel a base de gelatina (GbH) donde el alcohol polivinílico y el almidón funcionan como la columna vertebral del hidrogel. El GbH mostró propiedades físicas prometedoras con una superficie rica en grupos O-H. El GbH era pegajoso sobre superficies secas (vidrio, plástico y aluminio) y superficies húmedas (cerdo y pollo). La GbH demostró la cinética matemática para una formulación transdérmica, y la toxicidad in vitro e in vivo de la GbH en modelos de prueba confirmó el crecimiento saludable y la biocompatibilidad de los modelos. La GbH cargada con quercetina mostró una contracción de la herida del 45% al ​​50% en el día 4 para heridas por quemaduras de segundo grado en modelos de ratas que eran equivalentes al grupo de tratamiento con sulfadiazina de plata. Las estimaciones de resistencia a la tracción, bioquímicos, marcadores de tejido conectivo y NF-κB se restauraron el día 21 en las heridas curadas tratadas con GbH para imitar el nivel normal de la piel. El GbH bioinspirado promueve la cicatrización eficiente de heridas por quemaduras de segundo grado en modelos de ratas, lo que indica su aplicabilidad preclínica.

La búsqueda de inspiración de la naturaleza por parte de la humanidad ha llevado a la creación exitosa de hidrogeles1 novedosos y funcionales. La biomimética de la mucosidad protectora a base de babosas contribuyó al desarrollo de hidrogeles duros que se adhieren a la superficie de una combinación de alginato y poliacrilamida2,3. Recientemente se ha desarrollado4 un eficaz complejo de dopamina en diseño de hidrogel adhesivo de superficie, inspirado en animales acuáticos, como los mejillones, donde la dopamina actúa como ingrediente principal para la adhesión submarina. Muchos hidrogeles bioinspirados se han diseñado utilizando el biosistema como modelo para comprender sus diversas funciones, desde su arquitectura molecular hasta su geometría macroscópica5. Los hidrogeles son redes complejas tridimensionales (3-D) de cadenas de polímeros hidrofílicos y, dada su naturaleza hidrofílica, contienen cantidades significativas de agua6,7. Se hinchan cuando se exponen al agua, especialmente porque el cuerpo humano tiene agua como componente principal y los hidrogeles pueden contener grandes volúmenes de agua. Por lo tanto, les permite ser un excelente candidato para diversos usos biomédicos, como ingeniería de tejidos, administración de fármacos, materiales de autorreparación, biosensores y vendajes hemostáticos8,9.

El órgano más grande y esencial de nuestro cuerpo, la piel, es una capa defensiva externa. Los materiales clásicos para apósitos para heridas, como telas secas (gasa absorbente o algodón), tienen beneficios medicinales mínimos, provocan dolor y requieren ajustes frecuentes en el apósito, lo que causa angustia continua al paciente. Los hidrogeles son prometedores ya que promueven la curación al mantener un nivel de humedad adecuado en el sitio de la herida. La mayoría de los estudios sobre el cuidado de heridas consideran que los hidrogeles son los mejores candidatos para los apósitos, ya que tienen una estructura tridimensional que se asemeja a la matriz extracelular natural, lo que garantiza a la herida una atmósfera húmeda10,11. Las fracturas epiteliales y los sistemas conectivos sustentan la capacidad del cuerpo humano para garantizar una protección suficiente contra daños externos12. La piel parece ser el más vulnerable de todos los órganos del cuerpo humano, desde hematomas y rasguños hasta quemaduras. Estadísticamente, las lesiones por quemaduras son la cuarta forma de trauma debilitante más frecuente13. Se espera que un vendaje ideal para heridas por quemaduras promueva la recuperación en períodos más cortos y alivie el dolor, ya que las heridas por quemaduras requieren atención médica prolongada.

En la última década, la química de catecol inspirada en mejillones se ha convertido en una parte intrigante de la ciencia, especialmente en hidrogeles14, donde las composiciones de poliacrilamida y bis-acrilamida son una matriz común para un sistema de hidrogel atrapado en catecol15. Las investigaciones indican que el contacto prolongado o frecuente de poliacrilamida y bis-acrilamida con la piel puede desencadenar dermatitis y cáncer en modelos animales16. Los hallazgos preclínicos sugieren que la exposición continua a composiciones de poliacrilamida y bis-acrilamida en estudios de modelos animales comprometió los sistemas reproductivo y nervioso17. A pesar de que hay múltiples apósitos fácilmente disponibles en el mercado, se debe establecer una solución innovadora de tratamiento de heridas para tratar las lesiones por quemaduras. La investigación actual se basa en la hipótesis de que "la polidopamina exhibe una propiedad adhesiva en una composición no tóxica de formulación de hidrogel". Por lo tanto, se desarrolló el apósito para heridas GbH y se evaluó su desempeño físico y biológico en diversas superficies. Finalmente, se evaluó el patrón de liberación del fármaco del parche de hidrogel del vendaje para comprender el patrón de difusión del fármaco de la formulación en la cicatrización de heridas de quemaduras parciales de segundo grado en modelos de rata.

La optimización clásica adoptada en la presente investigación ha llevado al desarrollo de GbH con la propiedad pegajosa de un polidomino bioinspirado2,18. Los hidrogeles de PVA tienen numerosas aplicaciones en la industria farmacéutica y biomédica debido a su facilidad de procesamiento, biocompatibilidad, no carcinogenicidad, bioadhesividad, no toxicidad y naturaleza transparente. La mezcla de hidrogeles sintéticos como PVA, policaprolactona y ácido poliláctico con almidón asegura la abundancia de grupos hidroxilo y mejora las propiedades mecánicas19,20,21. El almidón, un biopolímero abundantemente disponible en la naturaleza, es rentable, ampliamente disponible con propiedades termoplásticas y eficientemente biodegradables. Sin embargo, un sistema basado en almidón exhibe con frecuencia malas propiedades mecánicas, quebradizas y altamente solubles en agua, y una modificación de polímero sintético demuestra ser ventajosa21,22. En el estudio actual, la mezcla de hidrogel de PVA-almidón, reticulada químicamente por el reactivo de glutaraldehído (GA) (Fig. 1a) obtenida del proceso de colada en solución, era transparente y no tenía propiedades adhesivas o pegajosas. La mezcla de hidrogel de PVA-almidón sirvió como base para agregar una propiedad pegajosa. Se agregaron varias concentraciones de polidopamina a la base de hidrogel y luego se realizó la prueba de elongación (Tablas 1 y 2). Se encontró que la concentración más baja de 0,5% era elástica y apropiadamente pegajosa (Fig. 1a.1), como se desea de una formulación de hidrogel, ya que un apósito para heridas debe resistir cualquier fuerza externa y proteger la herida.

Rendimiento esquemático y diverso de GbH: ( a ) Esquema del hidrogel basado en gelatina de superficie diversa desarrollado (GbH); (a.1) El GbH desarrollado es un proceso de dos etapas en el que los polímeros de alcohol polivinílico (PVA) y almidón, y la concentración optimizada de polidopamina polimerizada en álcali se entrecruzan químicamente con el reactivo de glutaraldehído (GA), que actúa como gel base; (a.2) El exceso de glutaraldehído en la etapa semipolimerizada se entrecruza con la gelatina y forma una red polimérica sobre el gel base. La red de gelatina impide el oxígeno externo e inhibe la oxidación de los grupos catecol.; Se utilizó la prueba de Benedict para determinar el exceso de glutaraldehído compuesto por: (b) PBS, (b.1) Tris-HCl, (b.2) AlCl2 y (b.3) agua destilada. El GbH desarrollado con estabilizador sobre diversas superficies: (c) pollo; (c.1) cerdo; (c.2) superficie de acero inoxidable; (c.3) superficie de vidrio y (c.4) superficie de plástico.

La incorporación de gelatina y metaperyodato de sodio en estado semipolimerizado aseguró la deseada propiedad pegajosa, que persistió durante cuatro días a TA (temperatura ambiente, 22 ± 3 °C). La mejor combinación se observó como 500 μL de gelatina con una proporción de 1:5 de polidopamina y metaperiodato de sodio. Investigaciones anteriores sobre hidrogel de polidopamina-poliacrilamida inspirado en mejillones mantuvieron suficientes grupos de catecol libres en el hidrogel y previnieron la sobreoxidación de polidopamina4. La poliacrilamida en el hidrogel inspirado en mejillones obstruyó el oxígeno externo e inhibió la oxidación de los grupos catecol al formar una red de polímeros. Los mejillones, en la naturaleza, previenen la sobreoxidación del grupo catecol al secretar proteínas reductoras ricas en cisteína, manteniendo así una fuerte adhesividad4. En la investigación actual, la red de gelatina evitó la sobreoxidación y obstaculizó la oxidación inmediata del grupo catecol, proporcionando así una propiedad pegajosa prolongada al catecol de hidrogel. El gel base está formado por la cadena reticulada de PVA-almidón (Fig. 1a.2). El agente reticulante GA reacciona con los grupos O–H adyacentes del PVA, formando glioxal cíclico23. El mismo entrecruzamiento ocurre entre el almidón y el PVA. Las fuertes interacciones de enlaces H entre PVA-almidón también ayudaron a la formación de la red. La polidopamina también interactúa con el gel base formando enlaces de hidrógeno con el N-H presente en los grupos estructurales. El exceso de GA reticula la gelatina y estabiliza la red24. Los restos de catecol en la polidopamina pueden sufrir varias interacciones superficiales en el tejido normal que dan como resultado la formación de enlaces covalentes interfaciales25.

El GbH se sometió a un proceso de lavado para eliminar el exceso de GA. Así, se determinó mediante el test de Benedict26 un tampón adecuado para promover la eliminación de un exceso del grupo funcional C-H-O. El cambio de color de verde oscuro a azul cristalino en la prueba de Benedict es indicativo de la eliminación del grupo C-H-O. Los tampones utilizados fueron Tris-HCl (3 M), cloruro de aluminio (AlCl2) (50 mM), solución salina tamponada con fosfato (PBS) (0,1 M) y agua destilada (Fig. 1b–b.3). La prueba de Benedict reveló que el PBS es ideal para fines de lavado (Fig. 1b), donde el lavado se realizó en tres ciclos de 6 h, luego se descartó el tampón y se rellenó el gel con PBS fresco para fines de conservación del gel, que se puede almacenar. a 4 °C en PBS o agua destilada. Los espectros de espectroscopia infrarroja transformada de Fourier (FT-IR) del gel lavado también respaldan la eliminación completa de GA; los detalles de IR se explican brevemente en la sección "Caracterización de GbH". La adherencia de la GbH a la superficie húmeda es posible gracias a los grupos de amina de la superficie presentes en el hidrogel27,28. El GbH se mantuvo en diversas superficies (durante la noche a temperatura ambiente) y se observó la adherencia de cada hidrogel a la superficie (Fig. 1c-c.4). El GbH se colocó sobre diferentes superficies húmedas, como pollo (Fig. 1c) y cerdo (Fig. 1c.1) y superficies secas, como acero inoxidable (Fig. 1c.2), vidrio (Fig. 1c.3) y plástico (Fig. 1c.4). La pegajosidad del metal, el vidrio y la carne de cerdo fue más fuerte que la de la carne de ave.

El hidrogel sintetizado a partir de polielectrolitos se hincha más debido a la repulsión de carga entre las cadenas poliméricas29. La propiedad de hinchamiento es deseable para la liberación controlada del fármaco30. El GbH está diseñado para el cuidado de heridas como material de vendaje y, por lo tanto, la presente formulación se cargó con tres medicamentos distintos, a saber. ciprofloxacina (fármaco antibacteriano), 5-flucitosina (fármaco antifúngico) y quercetina (fármaco que promueve la cicatrización de heridas) (Tabla 3). En el presente estudio, la GbH se cargó con diferentes concentraciones de fármaco (un mínimo de 5 mg/mL y un máximo de 20 mg/mL) dependiendo de la saturación y concentración efectiva de los fármacos a difundir. Los fármacos se solubilizaron en dimetilsulfóxido (DMSO) y se cargaron 200 μL de fármacos con gelatina. También se llevó a cabo un estudio de una combinación de fármacos (ciprofloxacina (100 μL) y quercetina (100 μL)) ya que la cicatrización de heridas requiere tanto protección bacteriana como fármacos que promuevan la cicatrización de heridas. El GbH sin ningún fármaco se incluyó como control de propiedades comparables.

El GbH había exhibido un buen hinchamiento en varios solventes y era comparable al control (Fig. 2a). Además, la naturaleza hinchable facilita la absorción de exudados y promueve un ambiente adecuado para la cicatrización de heridas. La GbH no se disolvió en ninguno de los solventes de prueba y se observó que el porcentaje de hinchamiento de la GbH sumergida en sangre se debía más a los componentes de la sangre29. En el estudio actual, la capacidad de hinchamiento se vio comprometida de forma insignificante a medida que aumentaba la concentración del fármaco. Al ser un candidato para el vendaje de heridas, se prefiere un hidrogel con un valor bajo de transmisión de vapor de agua (WVT) (Tabla 4), ya que la pérdida de líquido es limitada y se mantiene una atmósfera húmeda suficiente para la cicatrización de la herida22. Los informes indican que se experimenta una pérdida promedio de agua de ~ 250 g/m-2/d-1 de la piel normal a 35 °C, mientras que en una herida, la pérdida de agua aumenta considerablemente a 5000 g/m-2/d-1. y la pérdida se basará en la naturaleza de la lesión31. Se encontró que la GbH cargada con fármaco tenía una WVT comparativamente baja y es comparable con el control. Cuanto mayor es el agotamiento del agua, más imposible es que la herida cicatrice32. Por lo tanto, la hinchazón, la WVT y la capacidad de retención de humedad (MRC) son parámetros esenciales en los hidrogeles, que fomentan la absorción del exudado y limitan la transferencia de agua para garantizar una condición propicia para la cicatrización de heridas, proporcionando así una difusión adecuada del fármaco. Hubo un MRC razonablemente fuerte en el GbH preparado (Tabla 4) y todos los valores de MRC mostraron una diferencia insignificante con el control (Tabla 4) (GbH descargado de fármaco). Los hallazgos mostraron una reticulación adecuada incluso después de que el GbH se hubiera expuesto a 4 días de inmersión en agua destilada. La GbH preparada tenía una fracción de gel (GF) muy fuerte (Tabla 4) y todos los valores de GF eran comparables al control.

Caracterización de GbH: La evaluación física de GbH: (a) el comportamiento de hinchamiento de GbH en agua, solución de NaCl, solución de MgCl2 y sangre. La imagen SEM: (b) y (c) controlan GbH con un rango de tamaño de poro de 266-393 nm; (b.1) GbH cargada con fármaco de ciprofloxacina antibacteriana; (b.2) cicatrización de heridas que promueve la GbH cargada con fármaco de quercetina; (b.3) fármaco antifúngico GbH cargado con 5-flucitosina; (b.4) Combinación de fármaco antibacteriano ciprofloxacino y GbH cargado con quercetina. (c.1) imagen SEM del parche-A GbH antes de la liberación de ácido salicílico; (c.2) Imagen SEM del parche-A GbH después de la liberación de ácido salicílico (c.3) Imagen SEM del parche-B GbH antes de la liberación de ácido salicílico; (c.4) Imagen SEM de patch-B GbH después de la liberación de ácido salicílico. Características funcionales de la superficie ilustradas: (d) FT-IR de hidrogel estándar y GbH; ( e ) FT-IR de GbH con fármaco antibacteriano ciprofloxacina (C) cargado, fármaco que promueve la cicatrización de heridas, cargado con quercetina (Q), GbH con fármaco antimicótico 5-flucitosina (5F) cargado, GbH con fármaco antibacteriano ciprofloxacina y quercetina combinados (Q + C) cargado y GbH con el fármaco antifúngico 5-flucitosina y quercetina combinados (Q + 5F) cargados; (f) FT-IR del parche-A y -B. Caracterización DSC de parches: (g) GbH y (h) parche-A y -B. (i) XRD de GbH como parche-A y -B.

Se encontró que la superficie de GbH era densa en las imágenes del microscopio electrónico de barrido (SEM) y, con un aumento muy alto, se veían pocos poros, que oscilaban entre 266 y 393 nm (Fig. 2b, c). Una superficie densa se beneficia como apósito para heridas, ya que no fomenta que las bacterias se infiltren en el lugar de la lesión y provoquen infecciones fácilmente15. Una investigación similar sobre formulaciones de almidón de PVA encontró partículas de almidón insolubles en la superficie33 que no eran visibles en la superficie de GbH29. La observación de que no hubo cambios en la superficie en comparación con el GbH de control indica que los fármacos se mezclaron adecuadamente (uniformemente/apropiadamente) con el GbH, lo que garantiza un proceso uniforme de carga del fármaco (Fig. 2b.1–4,b.1–4). Aunque el GbH es de naturaleza translúcida, su color se puede cambiar en función de la carga de fármaco. El color de la GbH cambió a amarillo y lechoso turbio cuando se añadieron quercetina y 5-flucitosina, respectivamente.

Los espectros IR del hidrogel y GbH (Fig. 2d) mostraron un pico amplio en el rango de 3300–3500 cm−1, derivado del estiramiento intermolecular de O–H con enlaces de hidrógeno de los componentes34. El pico observado a 1636 cm-1 corresponde a la vibración N-H de la polidopamina (Fig. 2d), que se vio evidentemente en todos los espectros. Dado que los espectros no evidenciaron bandas de aldehído características, no habrá exceso de glutaraldehído. No hubo reducción en la intensidad de las bandas O-H incluso después de la incorporación de las drogas (Fig. 2e), lo que indica la abundancia de grupos O-H hidrofílicos aportados por sus componentes. Las investigaciones indican que las características adhesivas de los hidrogeles se asocian principalmente con los grupos O-H de la superficie del hidrogel que interactúan con grupos químicos como hidroxilo, amino y carboxilo en la superficie de los tejidos27,28,35. El pico de 1141 cm-1 reveló un estiramiento de C-O debido a los enlaces de hidrógeno intermoleculares formados entre las cadenas vecinas de PVA36. La vibración de estiramiento exhibida por el enlace C-O en los grupos C-O-C del almidón se encontró a 1025 cm-1 en el GbH, mientras que los picos correspondientes al estiramiento C-O de la gelatina se encontraron a 1080 cm-1 y 1030 cm−1 en los espectros de GbH (Fig. 2d). El pico que surge debido a la presencia de un grupo amida secundario se fusionó con la banda N-H de polidopamina en 1636 cm−1. Los espectros de GbH conservaron todos sus picos característicos en la región respectiva, lo que revela que no se produjeron interacciones químicas ni cambios estructurales tras la incorporación del fármaco (Fig. 2e y f).

El comportamiento térmico del GbH se estudió con termograma de calorimetría diferencial de barrido (DSC). El pico de endotermia de fusión para GbH se observa a 199 ° C (Fig. 2g). Esto se puede atribuir principalmente al componente principal como PVA; sin embargo, la Tm observada aquí es más baja que la reportada en la literatura para PVA puro, principalmente debido a las interacciones entre las cadenas de PVA y otros componentes, lo que hace que la naturaleza amorfa de GbH37. El GbH es térmicamente estable hasta 200 °C, mientras que el GbH incorporado al fármaco mostró una Tm más alta a 216 °C, atribuido a la interacción física entre el fármaco y el GbH (Fig. 2h). La característica cristalina o amorfa se revela a través de la difracción de rayos X en polvo (XRD) con un pico en 2θ = 9,4°, que representa el pico semicristalino de PVA38. La presencia de almidón en todos los casos fue evidente debido a la presencia de un pequeño pico de hombro a 9° (Fig. 2i). La intensidad de los picos se redujo con la incorporación de los fármacos. La disminución de la intensidad de los picos en el parche-A y -B revela la naturaleza amorfa de la GbH.

El perfil de liberación del fármaco se evaluó usando una dosis de fármaco al 1% de ácido salicílico. Se implementaron dos enfoques: patch-A, donde el GbH se preparó y se dispersó en ácido salicílico; patch-B, donde se sumergió el GbH en 10 mL de solución de ácido salicílico en acetona hasta evaporar la solución. La prueba de elongación de los parches indicó que el método de integración del fármaco no alteró la elongación de GbH (Tabla 5). Los parches mostraron un alargamiento igual al de los parches de control, es decir, la GbH sin fármaco.

La secuencia de liberación del fármaco (Fig. 3a) de los parches representaba que tanto el parche A como el B presentaban un porcentaje de liberación controlada del fármaco (CDR%) de 60,39 ± 2,25 % y 57,08 ± 2,02 %, respectivamente, en un período de 4 horas Patch-A y -B mostraron favorablemente un patrón idéntico con liberación lenta; por tanto, se observó un patrón regulado de liberación del fármaco. Una investigación de hidrogel de gelatina comparable registró el 100 % de la liberación del fármaco en 4 h, mientras que la GbH exhibió solo el 60 % de liberación del fármaco. Los estudios sugieren que la liberación del fármaco fue más rápida y el equilibrio alcanzado fue a las 3 h en un ambiente con suficientes medios de disolución39. Se observó que los parches A y B tenían una capacidad de carga de fármaco de 13,48 ± 0,17 y 11,42 ± 0,15 mg, respectivamente. El proceso de carga de fármaco mostró diferencias menores en las propiedades de la GbH, y el parche-B mostró una pérdida parcial (Tabla 5) en términos de elongación. El sistema de colada de solución es eficiente y tiene un gran potencial para la carga de fármacos en la presente investigación. La investigación de liberación del fármaco por difusión en agar produjo un color violeta/púrpura en las placas de agar debido a una reacción compleja entre el ácido salicílico difundido y el cloruro férrico (Fig. 3b, c), donde el gráfico muestra la zona de liberación del fármaco frente al tiempo, que determina la cinética de liberación del fármaco (Fig. 2c). En base al diámetro de la zona formada debido a la liberación del fármaco, se observaron las características de liberación controlada de la GbH. La liberación de ácido salicílico fue lenta y pudo observarse por la expansión del anillo de manera dependiente del tiempo. La GbH demuestra ser la formulación ideal para la difusibilidad del fármaco, lo que puede explicarse mediante otras observaciones cinéticas matemáticas.

Modelado matemático para el sistema de administración transdérmica de fármacos: evaluación dependiente del tiempo de la liberación de ácido salicílico de GbH: (a) ilustración gráfica del análisis espectrofotométrico del perfil de liberación controlada de fármacos de los parches A y B para ácido salicílico; (b) ilustración de la prueba de difusión en pocillos de agar para el perfil de liberación controlada del fármaco de los parches A y B; (c) ilustración gráfica del perfil de liberación controlada del fármaco de los parches A y B para la prueba de difusión en pozo de agar con ácido salicílico. Representación del modelo matemático de la liberación de fármacos de GbH: (d) cinética de liberación de orden cero, (e) de primer orden y (f) Higuchian. Difusión en agar de GbH: (gA) rendimiento de GbH estéril UV contra E.coli; (gB) Placa de control del rendimiento de GbH estéril UV contra E.coli; (gC) rendimiento de GbH estéril UV contra S. aureus; (gD) Placa de control del rendimiento de GbH estéril UV contra S. aureus; (gE) Rendimiento de GbH no estéril frente a E.coli; (gF) Placa de control de rendimiento de GbH no estéril frente a E.coli; (gG) Rendimiento de GbH no estéril frente a S. aureus; (gH) Placa de control de rendimiento de GbH no estéril frente a S. aureus; (gI) rendimiento de GbH estéril frente a UV frente a C. albicans; ( gJ ) Placa de control del rendimiento de GbH estéril por UV contra C. albicans; (gK) Rendimiento de GbH no estéril frente a C. albicans y (gL) Placa de control de rendimiento de GbH no estéril frente a C. albicans. (h) ilustrar el rendimiento de la superposición de agar de GbH donde E, S y CA indican E. coli, S. aureus y C. albicans, respectivamente; C denota placa de control; C(H) indica control positivo GbH; D(H) indica GbH cargada con fármaco de prueba. (i) ilustra el rendimiento del agar parche de GbH donde D1, D2 y D3 son los días 1, 2 y 3, respectivamente; E, S y CA indican E. coli, S. aureus y C. albicans, respectivamente; C denota parche de algodón; D(C) denota parche de algodón cargado de droga; H denota GbH y D(H) denota GbH cargada de fármaco.

El valor del % de CDR se considera además para el análisis del modelo estadístico del patrón de liberación del fármaco GbH. Se graficaron las cinéticas de liberación en cero (Fig. 3d), primer orden (Fig. 3e) y Higuchian (Fig. 3f) del patrón de liberación del fármaco para el parche-A y -B40. Los gráficos reflejan la forma estadística de la formulación de la liberación transdérmica del fármaco. En un análisis de modelo de orden cero, los datos de los ensayos de liberación de fármacos in vitro se representan como la cantidad total de fármaco liberado frente al tiempo (Fig. 3d). Esta relación puede explicar la difusión de fármacos de formas de liberación de fármacos, incluidos los sistemas transdérmicos, tabletas de matriz con fármacos poco solubles en formas recubiertas y sistemas osmóticos41. El modelo de primer orden representa un porcentaje logarítmico acumulativo del fármaco restante frente al tiempo, lo que dará como resultado una línea recta con una pendiente de − K/2303 (Fig. 3e). Esta asociación se puede utilizar para categorizar la disolución de fármacos en tipos de dosificación de prescripción, como los que comprenden fármacos solubles en agua en matrices porosas41. La cinética de Higuchi solo se ocupa del porcentaje total de liberación del fármaco frente a la raíz cuadrada del tiempo (Fig. 3f). Esta correlación se puede utilizar para explicar la disolución del fármaco de muchos tipos de formulaciones de dosificación de fármacos de liberación modificada, como los sistemas transdérmicos y las tabletas de matriz con fármacos solubles en agua41.

La liberación del fármaco de ácido salicílico de la matriz de GbH se ajusta al concepto de cinética de primer y cero orden (para el parche A, r2 = 0,984 y r2 = 0,99; para el parche B, r2 = 0,894 y r2 = 0,95, respectivamente) (Fig. .3d,e). El parche A también sigue la cinética de Higuchi con un coeficiente de correlación relativamente cercano (r2 = 0,952), pero el parche B tenía un valor más bajo que el parche A (Fig. 3f). El parche B tiene un valor más bajo en el modelo cinético de orden cero en comparación con el parche A (Fig. 3d). De manera similar, un informe anterior sobre los modelos matemáticos de hidrogel a base de gelatina reveló que el hidrogel desarrollado de la misma manera que el parche B tiene una menor liberación de fármaco que el parche A debido a los complejos esterificados que dificultan la liberación de la molécula salicílico39. De acuerdo con la validación de los modelos matemáticos para un sistema de administración transdérmica de fármacos, el parche A sigue perfiles de liberación de tres fármacos, es decir, modelo de orden cero, de primer orden y de Higuchian, pero el parche B tiene un valor más bajo en comparación con el parche -A para el modelo de orden cero e Higuchian. Se ha observado un patrón de liberación de fármacos similar para el diclofenaco sódico atrapado en hidrogeles a base de polietilenglicol y polietilenglicol-policaprolactona42. Patch-A y -B, como se discutió, obedecen las tres leyes cinéticas, donde el proceso de difusión libera ácido salicílico. El fármaco utiliza el mismo canal utilizado para difundirlo en la matriz, lo que puede confirmarse mediante análisis SEM antes y después de la liberación del fármaco del parche-A (Fig. 2c.1,c.3). La superficie rugosa observada antes de la liberación es una superficie lisa en las imágenes SEM posteriores a la liberación del fármaco (Fig. 2c.2,c.4) del parche-B, que es comparable a la superficie del control GbH (Fig. 2c). Los resultados de IR (mencionados en la sección "Caracterización de GbH" y la Fig. 2f) mostraron la presencia prominente del grupo funcional O-H en la superficie de GbH y la carga de fármaco no alteró mucho los grupos funcionales de superficie.

Los apósitos de hidrogel principalmente mantienen el área de la herida húmeda y la protegen de infecciones. La porosidad observada en el análisis SEM de GbH (sección: "Caracterización de GbH" y Fig. 2b, c) es indicativa de ventajas como alta concentración local del ingrediente activo, liberación lenta e hinchamiento. La difusión del fármaco desde GbH se probó frente a microorganismos (Escherichia coli MTTC 443, Staphylococcus aureus MTTC 96 y Candida albicans MTTC 183) utilizando métodos basados ​​en agar, como difusión en agar, superposición de agar y parche de agar. Estos métodos muestran la eficiencia de liberación de fármacos de GbH y su desempeño en el control de infecciones. En la presente investigación, la GbH esterilizada superficialmente y sin esterilizar (Fig. 3 gA–gL) se analizó mediante el método de difusión en agar. La GbH demuestra una fuerte difusibilidad tanto en concentraciones bajas como altas de fármacos, es decir, 5 mg y 20 mg. Los dos anillos distintos observados en la zona de inhibición podrían deberse a la lenta difusividad del fármaco desde la GbH. El gel esterilizado o sin esterilizar tiene poco efecto sobre la difusibilidad del fármaco a través de la GbH. El sistema de superposición de agar (Fig. 3h) mostró una fuerte difusibilidad del fármaco a concentraciones más bajas (5 mg) y la GbH con los fármacos de prueba no mostró crecimiento microbiano en comparación con los controles. Por lo tanto, el GbH es una opción exitosa para la protección de heridas contra infecciones bacterianas (Fig. 3g.A–gH) y fúngicas (Fig. 3g.I–gL).

Las pruebas y los controles, como en la investigación con agar parche (Fig. 3i), se infectaron con un hisopo de E. coli gramnegativo y S. aureus grampositivo para estudios antibacterianos incubados a 37 °C. Las placas antifúngicas se inocularon con C. albicans y se incubaron a 27 °C. El estudio se realizó durante un período de tres días en los que se tomó un hisopo del área contaminada y se controló el crecimiento bacteriano y fúngico en placas de agar nutritivo y agar papa dextrosa, respectivamente. Los hallazgos presentes (Fig. 3i) mostraron que el GbH cargado con medicamentos realizó una actividad antimicrobiana superior en comparación con el GbH sin medicamentos y controles. Se observó un crecimiento microbiano denso en la muestra cargada con fármaco del parche de algodón del día 1. El sistema de parche de agar cargado con fármaco y sin carga de fármaco demostró la capacidad de GbH para evitar infecciones debido a su vendaje suave para heridas con una fuerte propiedad de difusividad. .

La toxicidad de la GbH se evaluó a tres niveles mediante el ensayo MTT. El ensayo de primer nivel que utilizó líneas celulares L929 permitió la selección del estabilizador adecuado, lo que hizo que la GbH no fuera tóxica. Los ensayos de segundo nivel determinan la viabilidad celular durante el contacto indirecto de GbH (lixiviado de GbH) con líneas celulares 3T6. Finalmente, en el tercer nivel, se probó la inercia de la GbH por contacto directo e indirecto (lixiviado de GbH) de la GbH utilizando células HaCat. Varios estabilizadores, como la quercetina (QU), el eugenol (EU), la vitamina C (Vc) y el metaperiodato de sodio (SmP), se sometieron a ensayos de MTT a diferentes concentraciones (1:0,5, 1:1, 1:1,5 y 1: 2) de la proporción de polidopamina a estabilizador (Fig. 4a). Curiosamente, se observó una viabilidad celular razonable de ~ 50 % en una relación 1:1 de polidopamina a metaperyodato de sodio. Por lo tanto, el SmP fue elegido como estabilizador para los ensayos de segundo nivel utilizando estándares polacos43. La evaluación MTT de la toxicidad del medio lixiviado del biomaterial en células 3T6 reveló sus propiedades no tóxicas. Entre las proporciones de polidopamina al estabilizador, SmP (1: 1, 1: 2, 1: 3 y 1: 4) comparadas aquí, 1: 4 mostró una viabilidad celular> 80% (Fig. 4b), que fue aún más probado en varias cantidades reemplazando el 100% del medio de cultivo con el medio de lixiviado del biomaterial (Fig. 4c). Aunque se reemplazaron varios porcentajes (25, 50 y 100%) del medio de lixiviado del biomaterial, no hubo un impacto negativo importante de la GbH en la viabilidad de las células 3T6 y fue comparable a los controles, a saber, hidrogel de almidón de PVA y el Base GbH. El ensayo final de MTT se llevó a cabo en la línea celular HaCat (Fig. 4d) con dos métodos diferentes, contacto directo e indirecto de GbH (Fig. 4d.1). La viabilidad celular no se vio afectada, es decir, 100% en ambos métodos de prueba y los valores observados fueron comparables a los controles de crecimiento (Fig. 4d).

Desempeño in vitro e in vivo de GbH como material de apósito para heridas por quemaduras de segundo grado: Evaluación de citotoxicidad de GbH utilizando células L929: (a) Viabilidad celular de L929 cuando se expone a GbH durante 24 h, donde Hb es una base de hidrogel sin estabilizador y la leyenda indica la concentración (mg) de cada estabilizador de prueba; ( b ) Viabilidad celular de 3T6 cuando se expone al medio de lixiviado de GbH durante 24 h, donde Ctr es la base de GbH sin estabilizador y la leyenda indica la proporción de polidopamina a metaperyodato de sodio y ( c ) Viabilidad celular de 3T6 cuando se expone al medio Medios de lixiviado de GbH durante 24 h a un porcentaje diferente, donde Ctr es la base de GbH sin estabilizador y la leyenda de la relación indica la relación de polidopamina y metaperyodato de sodio en la GbH. ( d ) Viabilidad celular de HaCat cuando GbH está en contacto con las células (GbH colocado) y medio lixiviado al 100% de reemplazo de medio incubado durante 24 h, donde Ctr indica control, Ctr 37 ° C indica el control positivo; (d.1) Evento observado de células HaCat sanas después de 24 h en contacto con GbH, donde la flecha blanca indica la GbH y la flecha negra indica células HaCat sanas en una placa de 96 pocillos. Desarrollo observado de camarones en salmuera cuando se exponen a GbH durante 24 h, (e) Control positivo: nauplios del tanque aireado; (e.1) Control: nauplios en agua salada artificial; (e.2) y (e.4) Ensayo: nauplios en medio 1:1 del tampón lixiviado GbH y agua salada artificial; (e.3) y (e.5) Prueba: El GbH colocado en camarones en salmuera en un medio de agua salada artificial. Prueba de toxicidad a corto plazo en etapas de embrión y alevines de saco del modelo de pez cebra: (f) Desarrollo observado de pez cebra cuando se expone a GbH (contacto directo de GbH y medio 1: 1, es decir, el tampón de lixiviación de GbH y medio E3) durante 18 –96 HPF; (f.1) Huevos de pez cebra sanos observados a las 48 hpf en contacto con el GbH. Fotomicrografías que muestran la histopatología de la piel en ratas. Apariencia normal del epitelio en las ratas macho (g) y hembra (g.1) del grupo de control. Mínima acantosis de las ratas macho (g.3) y hembra (g.4). Aspecto normal de la dermis en la rata de control (g.2) y mínima infiltración de células inflamatorias en el grupo tratado (g.5).

El efecto del contacto directo e indirecto de GbH se exploró a través de ensayos basados ​​en modelos in vitro utilizando embriones de artemia salina (Artemia salina) y pez cebra (Danio rerio). El ensayo de letalidad de camarones en salmuera es una prueba rápida para evaluar la citotoxicidad44. El GbH sumergido en tampón de fosfato, incubado a 35–37 °C durante 24 h, se usó como solución de prueba para el ensayo de camarones en salmuera. Los nauplios eclosionados a las 24 h (n = 10) se inocularon en diferentes proporciones (1:4, 1:1 y 1:0) de la solución de prueba y agua de mar artificial. El desarrollo de las crías activas hasta la etapa naupliar con un crecimiento saludable en el tamaño del cuerpo y el pelo de la antena (Fig. 4e-e.5) fue indicativo de la naturaleza no tóxica de la solución de prueba de GbH. Las muestras de contacto directo de GbH sumergidas en agua de mar también mostraron un patrón de crecimiento similar al de los nauplios. Se observó una tasa de mortalidad del 10% en la proporción 1:0 utilizada en el ensayo indirecto, lo que se atribuye a la presencia de bajo contenido de agua salada. Mientras que se observó una tasa de mortalidad del 15% en el contacto directo de las muestras sumergidas en GbH debido a que los nauplios se enredaron en la GbH. (Figura 4e.5)45. Los controles mantenidos en las placas incubadas y en la pecera aireada mostraron patrones de crecimiento naupliar similares.

El ensayo de prueba de embriones de peces (FET) utilizando embriones de pez cebra (n = 10) (Fig. 4f, f.1) se realizó de manera similar al ensayo de letalidad de camarones en salmuera con una ligera modificación utilizando medio E346. Los embriones se observaron cada día para registrar cualquier cambio en el desarrollo debido a su exposición a la GbH directamente y a la solución de prueba lixiviada de GbH de acuerdo con las directrices de la OCDE para probar productos químicos No. 212: Peces, prueba de toxicidad a corto plazo en embriones y alevines. etapas47,48. Las observaciones apicales se realizaron en cada embrión ensayado (Fig. 4f, f.1) cada 24 h hasta las 96 h postfecundación (hpf) y el escalamiento de severidad (Tabla 6) de la toxicidad de la GbH sobre el desarrollo de los embriones fue grabado. Las otras observaciones incluyeron desarrollo ocular, movimiento, circulación sanguínea y pigmentación, desarrollo cabeza-cuerpo, aleta pictórica y boca protuberante49. Además, se documentó el comienzo de la eclosión a las ~ 72 h tanto en el grupo de tratamiento como en el de control (Fig. 4f, f.1). Los resultados negativos (Tabla 6) en la escala de severidad indicaron el desarrollo saludable del embrión de pez cebra al contacto directo e indirecto con el GbH.

El experimento de toxicidad dérmica aguda se llevó a cabo de acuerdo con las pautas regulatorias de OECD-402 para la prueba de productos químicos50. El estudio de confirmación y determinación del rango de toxicidad se realizó utilizando ratas albinas Wistar sanas seleccionadas (n = 10) después de la aclimatación. El material de prueba, GbH, no produjo mortalidad ni mostró ningún signo clínico de toxicidad (Tabla 7) en las ratas albinas Wistar probadas durante todo el período de observación (14 días). Bajo las condiciones de prueba de OECD-402, el experimento no arrojó la LD50 dérmica de GbH en ratas y la formulación no fue tóxica hasta 2000 mg/kg de peso corporal (> 2000). Las ratas expuestas a GbH sobrevivieron al protocolo experimental y fueron sacrificadas, ya que no se requirió la necropsia (Tabla 8). Los resultados histopatológicos (Fig. 4g-g.5) claramente no muestran signos de inflamación o anomalías en la región aplicada de la GbH en los grupos de hombres y mujeres.

El ensayo de herida por rasguño in vitro demostró una migración celular eficiente en los rasguños en las células HaCat, que se expusieron al lixiviado de GbH y GbH cargado con quercetina en el medio (Fig. 5a). El rasguño de la monocapa celular se cerró parcialmente en comparación con los controles dentro de las 24 h posteriores a la exposición al medio de lixiviado del biomaterial. Las imágenes capturadas a intervalos fueron calificadas para probar la naturaleza no tóxica de las GbH, que favorecen una migración celular eficiente para el cierre de la herida51. El cierre observado de la brecha artificial, 'el rasguño', en la monocapa de células confluentes de células HaCat, donde las células en el borde de la brecha recién creada se movieron hacia la abertura para cerrar el 'rasguño'. Por lo tanto, se establecieron nuevamente nuevos contactos célula-célula en el GbH cargado y no cargado de quercetina (Figura. a. 24 hQ-GbH). Se informó una observación similar del cierre eficiente de heridas del ensayo de rascado isquémico in vitro con bajos niveles de infiltración de células inmunitarias y citoquinas debido a la quercetina52. Informes anteriores sobre el análisis de liposomas cargados de quercetina desarrollados en diferentes cantidades de carbopol y gelatina condujeron a una curación acelerada de la lesión, lo que redujo sustancialmente el tiempo de cierre de la herida53. Numerosos investigadores han desarrollado la quercetina como fármaco modelo para promover la cicatrización de heridas54,55.

Rendimiento de curación de heridas de GbH: ( a ) Rendimiento de curación de heridas por rasguños de células HaCat en 100% reemplazadas del medio incubado con GbH. (b) Cambios en la resistencia a la tracción de la piel en el grupo Normal, Control, base de crema (Crema), crema cargada con quercetina (QC), base GbH (hidrogel), GbH cargada con quercetina (QH) y grupos tratados con sulfadiazina de plata (SS). Los resultados se representan como la media ± DE con n = 6 en cada grupo p < 0,05 en comparación con el grupo Normal; pb < 0,05, en comparación con el grupo Control; cp < 0,05, en comparación con el grupo Crema, dp < 0,05, en comparación con el grupo QC, ep < 0,05, en comparación con el grupo Hidrogel, fp < 0,05, en comparación con el grupo QH, gp < 0,05, en comparación con el grupo SS. (c) El efecto de los tratamientos sobre la contracción de la herida por quemadura (%) el día 4, el día 7, el día 11, el día 14 y el día 21 fue una contracción de la herida superior y más rápida en comparación con los grupos control y placebo. (d) Cambios en la contracción de la herida de los grupos tratados con normal, control, crema, QC, hidrogel, QH y SS.

La ingesta nutricional, el consumo de agua y la masa corporal de las ratas Wistar que habían sufrido quemaduras permanecieron inalteradas. Inmediatamente después de la lesión por quemadura, la piel de la región dorsal mostró hinchazón. Las lesiones eran evidentes en forma de parches rojos a partir del día 4 y se encontró que los tejidos necróticos estaban recubiertos con una costra el día 7.

Se observó una epitelización temprana de las heridas (Tabla 9) en los grupos tratados que recibieron el grupo tratado con quercetina GbH al 1% (QH) y sulfadiazina de plata (SS). El grupo de control no mostró una cicatrización adecuada de las heridas hasta el día 21, mientras que QH y SS exhibieron una epitelización temprana de las heridas a partir del día 14 y 16, respectivamente. Los grupos de placebo (es decir, el grupo tratado con base de crema (Crema) y el grupo tratado con base de GbH (Hidrogel) observaron una epitelización temprana desde el día 16 y 17. Los grupos de placebo significan el efecto positivo de la formulación de GbH y crema cargada con fármaco.

Los especímenes de tejido de prueba se sujetaron a máquina y la fuerza máxima generada para rasgar los especímenes indicó la calidad del tejido. Se observó una diferencia significativa en la resistencia a la tracción del tejido (Fig. 5b) entre el control y todos los grupos de tratamiento (p < 0,05). Indicando la necesidad de atención de las heridas por quemadura, la resistencia a la tracción de los grupos QH y SS fue de 24,4 y 23,37 N, respectivamente, mientras que el grupo de control registró 3,77 N. Una mejor resistencia a la tracción de los grupos QH y SS fue de un rango similar, mientras que el grupo placebo de Crema e Hidrogel base tratado mostró 10,1 N y 19,32 N con una diferencia significativa (p < 0,05) en comparación con la formulación cargada de fármaco, lo que enfatiza el papel positivo de la GbH en la cicatrización de heridas por quemaduras. La recuperación de la resistencia a la tracción de QH y SS demostró la normalización de la piel con una resistencia a la tracción de 28,45 N al día 21.

El porcentaje de contracción de la herida (Fig. 5c, d) fue significativamente mayor (p <0,05) para los grupos QH y SS en comparación con el grupo de control. El resultado del cierre de heridas mediado por GbH en la quemadura de segundo grado en el modelo de rata ha demostrado ser beneficioso. Los animales tratados con QH mostraron un cierre de heridas más sustancial (45,00 ± 1,46 % el día 4; 98,24 ± 3,1 % el día 14) que los tratados con SS (47,67 ± 1,8 % el día 4; 96,4 ± 2,2 % el día 14) y el grupo de control no tratado (18,00 ± 2,5 % el día 4; 54,52 ± 1,25 % el día 14) el día 4 y el día 14, respectivamente (Fig. 5, d). Los estudios morfológicos macroscópicos mostraron una disminución de la inflamación y el enrojecimiento y una cicatrización limitada en el grupo QH el día 14. Además, la epidermis se rejuveneció a la arquitectura normal de la piel en las heridas tratadas con QH y SS, mientras que se observaron signos de inflamación y cierre prematuro de la herida en el grupo QH. grupos de control el día 21 (Fig. 5d)

Los niveles de malondialdehído (MDA) (Fig. 6a) de las muestras de tejido tratadas con QH se registraron como 0.814 nmoles MDA/mL y fueron más bajos que el grupo de control (p < 0.05) con 2.147 nmoles MDA/mL, mientras que la piel normal se registró como 0,705 nmoles MDA/mL. Un aumento sustancial (p < 0,05) en el grupo de control MDA es un signo de daño por peróxido de lípidos, lo que significa daño por radicales libres, lo que lleva a una cicatrización incompleta de la herida el día 21. Los niveles de MDA de los grupos tratados con QH y SS fueron 0,814 y 0,827 nmoles MDA/mL, respectivamente e idénticos entre sí y comparables al tejido normal de la piel. Los niveles reducidos de MD en las muestras tratadas con QH indican el efecto de la quercetina en la reducción de la peroxidación lipídica y la protección antioxidante durante la cicatrización de heridas por quemaduras. La protección antioxidante contra la lesión oxidada inducida por quemaduras mediante el uso de tratamientos orales y tópicos de mirto (Myrtus communis) se informó anteriormente56. Así, la reversión de los índices bioquímicos se atribuye al potencial efecto antioxidante de los compuestos antiinflamatorios.

Cambios en la cicatrización de heridas in vivo en (a) MDA; (b) GSH; (c) CAT; (d) HXP; (e) HXA y (f) niveles de NF-κB del grupo Normal, Control, crema base (Crema), crema cargada con quercetina (QC), base GbH (hidrogel), GbH cargada con quercetina (QH) y sulfadiazina de plata (SS) grupos tratados. Los resultados se representan como la media ± DE con n = 6 en cada grupo p < 0,05 en comparación con el grupo Normal; pb < 0,05, en comparación con el grupo Control; cp < 0,05, en comparación con el grupo Crema, dp < 0,05, en comparación con el grupo QC, ep < 0,05, en comparación con el grupo Hidrogel, fp < 0,05, en comparación con el grupo QH, gp < 0,05, en comparación con el grupo SS. Imagen 2-D y 3-D de la interacción de quercetina con: (g) y (g.4) interacción objetivo 1SVC; (g.1) y (g.5) interacción objetivo 3BRV; (g.2) y (g.6) interacción con el objetivo 1NFI, y (g.3) y (g.7) interacción con el objetivo 2E7A.

Tanto los antioxidantes no enzimáticos como los enzimáticos, es decir, el glutatión (GSH) y la catalasa (CAT), respectivamente, juegan un papel destacado en la regulación dinámica de los niveles de oxígeno reactivo y su daño previsto, favoreciendo la cicatrización de heridas57,58. En las muestras de control, los niveles de GSH (Fig. 6b) y CAT (Fig. 6c) se registraron como 2,24 μ mol/g y 14,83 μ moles de peróxido de hidrógeno utilizado/mg/tejido/min, respectivamente. Se observó una reducción significativa en los niveles de GSH (Fig. 6b) y CAT (Fig. 6c) en el grupo de control en comparación con los grupos tratados y normales (p < 0,05). Los grupos tratados con QH y SS tenían como objetivo restaurar la función tisular regular de GSH (2,13 y 2,14 μ mol/g de tejido, respectivamente) y CAT con (22,41 y 25,341 μ moles de peróxido de hidrógeno utilizado/mg/tejido/min) que es comparable a la del grupo normal con 2,24 μ mol/g de GSH tisular y 30,182 μ moles de peróxido de hidrógeno utilizados/mg/tejido/min de CAT (fig. 6b y c). El QH restauró significativamente (p < 0,05) los niveles de GSH y CAT al día 21, en comparación con los placebos (GSH: 1,48 y 1,8 μ mol/g, y CAT: 15,533 y 18,207 μ moles de peróxido de hidrógeno utilizado/mg/tejido/ min para los grupos Crema e Hidrogel) y el grupo tratado con base de crema (QC) de quercetina al 1% con 1,65 μ mol/g de tejido y 28,554 μ moles de peróxido de hidrógeno utilizados/mg/tejido/min, respectivamente.

Los niveles de hidroxiprolina (HXP) y hexosamina (HXA) en los tejidos de prueba se pueden correlacionar con la cicatrización observada. El HXP es el elemento crítico del colágeno, mientras que el HXA son los sustratos básicos para construir los componentes del tejido conectivo59. Por lo tanto, los niveles de HXP y HXA representan un candidato perfecto para un marcador de tejido conectivo en la cicatrización de heridas. Durante el proceso de curación, los contenidos de HXP y HXA aumentaron en todos los grupos tratados en relación con el grupo de control (Fig. 6d y e). Los niveles de HXP y HXA del grupo quemado sin ningún tratamiento fueron de 38.911 y 40.477 μg/mL, respectivamente, significativamente menor (p < 0.05) en comparación con el grupo normal con 97.546 y 107.752 μg/mL, respectivamente. Los grupos QH y SS restauraron sus niveles funcionales de HXP y HXA a 83.053 y 76.343 y 95.698 μg/mL y 89.22 μg/mL, como se observó en el grupo normal con 97.546 y 107.752 μg/mL el día 21. El QH se restauró sustancialmente ( p < 0,05) los niveles de HXP y HXA en comparación con los grupos placebo (HXP: 52,858 y 58,729 μg/mL, y HXP: 63,559 y 66,898 μg/mL para los grupos Crema e Hidrogel) y QC (HXP: 68,160 y HXA: 73.785 μg/mL) como el día 21. Curiosamente, el grupo SS registró 76.343 y 89.221 μg/mL de niveles tisulares de HXP y HXA, similar al grupo QH. La disminución sustancial de los niveles de HXP y HXA en el contenido de tejido de control indica niveles bajos de colágeno, formación insuficiente de tejido conjuntivo y un proceso inadecuado de cicatrización de heridas. Por lo tanto, la observación en el grupo tratado con QH destaca la propiedad curativa prevista de la formulación.

Las funciones del NF-κB son varias en la cicatrización de heridas, ya que modula la inflamación y la supervivencia celular y promueve la remodelación de las uniones celulares y el ensamblaje de una estructura citoesquelética alrededor de la herida60. Los niveles de NF-κB del grupo control fueron de 5,88 ng/mL y fueron significativamente altos (p < 0,05) en relación con el grupo normal con 3,95 ng/mL, lo que implica una persistencia de la inflamación. Los grupos tratados con QH y SS restauraron sus niveles funcionales habituales de NF-κB y se observaron a 3,61 y 3,52 ng/mL, niveles similares a los del grupo normal (Fig. 6f) en los niveles tisulares de NF-κB. El QH restauró sustancialmente (p < 0,05) los niveles de NF-κB en comparación con los placebos (5,11 y 4,75 ng/mL de niveles tisulares de NF-κB de los grupos Crema e Hidrogel) y los grupos tratados con QC (4,46 ng/mL de niveles tisulares de NF-κB). ) como el día 21. Por lo tanto, los resultados enfatizan el efecto de la GbH para facilitar la cicatrización de heridas y restaurar el funcionamiento esperado de NF-κB similar a un tejido de piel normal.

El factor de transcripción NF-κB y la citocina multifuncional TNF-α son potentes mediadores inflamatorios que desempeñan activamente funciones predominantes en eventos celulares como la supervivencia, proliferación, diferenciación y muerte celular61. Los investigadores han establecido la quercetina como un medicamento modelo para mejorar la cicatrización de heridas53,56, y el estudio actual destaca los efectos beneficiosos de la GbH suplementada con quercetina en la recuperación de heridas por quemaduras de segundo grado en modelos de ratas. El análisis in silico de la quercetina frente a los posibles objetivos mediadores inflamatorios (Fig. 6g–g.8 y Tabla 10) observó una excelente puntuación de unión y enlaces de hidrógeno a múltiples aminoácidos. El compuesto se une al dominio p50 de la proteína 1SVC, que se traslada al núcleo, donde se une al ADN (Fig. 6g, g.4). La región de bobina enrollada de 3BRV se encuentra entre las posiciones 49–356 (Fig. 6g.1, g.5). Muchas regiones de tipo bobina enrollada están involucradas en funciones biológicas críticas, como la regulación de la expresión génica. La región entre 44 y 111 de 3BRV participa activamente en la interacción con CHUK/IKBKB, lo que permite la fosforilación de RelA/p65 mediada por IKK, que en general promueve activamente una respuesta inflamatoria a través de la activación de NF-κB. La región del dominio de 1NFI (Fig. 6g.2,g.6) entre 19 y 306 regula funcionalmente la accesibilidad del promotor del gen diana RelA. La quercetina forma enlaces de hidrógeno con aminoácidos en la región del dominio 1NFI, lo que la vuelve funcionalmente inactiva. La mutagénesis en las posiciones 105 y 108 de la proteína 2E7A (Fig. 6g.3,g.7) ha llevado a una baja actividad e inactividad62. El acoplamiento actual destaca la unión de quercetina en la región activa de 2E7A.

La piel normal (Fig. 7a) muestra una arquitectura con una capa de epidermis y dermis bien definida en la evaluación histopatológica. La capa epitelial (x) está intacta sin signos de inflamación. La dermis tiene muchas glándulas sebáceas (b) y fibras colágenas bien definidas (c) en la capa superior de la dermis. En el grupo de control (Fig. 7a.1), hay una pérdida completa de la epidermis y una destrucción sustancial de las capas superficiales de la piel (d). La desintegración citoplásmica vacuolar en la capa de células basales es prominente (e) junto con la infiltración de neutrófilos en el sitio de la lesión (f). La piel muestra coagulación de la epidermis y la dermis, y el colágeno desnaturalizado aparece hinchado (g), homogéneo e infiltrado por células exudativas. El grupo de placebo, el grupo tratado con crema base (Fig. 7a.2), mostró un tejido curado por quemadura con inflamación moderada, sin signos de regeneración epitelial o dérmica (h). La capa de células basales permanece degenerada (i) y marcadamente vacuolada, lo que indica una cicatrización impedida. Las fibras de colágeno permanecen degeneradas (j) sin signos de regeneración microvascular. De manera similar, el grupo de placebo, el grupo tratado con hidrogel base (es decir, el GbH) (Fig. 7a.4), exhibe epitelio con algunos signos de crecimiento regenerativo (k). Una disminución marginal en la vacuolización de la capa de células basales (l) indica curación del tejido, y es evidente una disminución en la hinchazón de las fibras de colágeno (m).

Evaluación histopatológica de la herida por quemadura el día 21: se encontró una morfología estándar de la epidermis, la dermis y la hipodermis durante las fotomicrografías de un examen histopatológico del grupo Normal (a). Se observó que el grupo Control (a.1) tenía características marcadas de desarrollo de costras por quemadura en la dermis y la epidermis, agregación extrema de leucocitos, congestión de los vasos sanguíneos, folículos pilosos y glándulas sebáceas. Se observaron leucocitos moderados, destrucción de vasos sanguíneos y degeneración degenerativa de los folículos pilosos y las glándulas sebáceas en la aplicación tópica de la Crema y el grupo placebo de GbH (Hidrogel) (a.2) y (a.3). La crema tratada con quercetina y el grupo GbH (QC, QH) y sulfadiazina de plata (SS) (a.4), (a.5) y (a.6) no presentaron síntomas de acumulación de leucocitos, favorecidos por la regeneración del epitelio. La arquitectura de la piel restaurada refleja la regeneración de la epidermis tras la aplicación tópica de GbH cargada con quercetina, que está de acuerdo con la piel normal.

El grupo tratado con crema cargada de fármaco, es decir, QC (Fig. 7a.3), tenía como objetivo regenerar las capas de la epidermis y la dermis, donde su diferenciación es evidente (q). Se observa una restauración significativa de la arquitectura de la capa de células basales en forma de edema marcadamente reducido y signos insignificantes de vacuolización (r). Sin embargo, la cicatrización de la capa de la dermis sigue siendo incompleta con la presencia de pequeñas vacuolas en las fibras de colágeno. Se puede observar una regeneración significativa del epitelio en el grupo de tratamiento con GbH asistido por fármacos, es decir, QH (Fig. 7a.5). La diferenciación en las capas de la epidermis y la dermis parece casi restaurada a una arquitectura histológica normal (t). La presencia de glándulas sebáceas (u) indica una restauración fisiológica de la función del tejido de la piel. La capa de células basales parece normal en forma y arquitectura, sin signos de inflamación (v). Las fibras de colágeno en la dermis no muestran signos de hinchazón u otras características inflamatorias (w). El control positivo del grupo tratado con crema SS (Fig. 7a.6) muestra una evidente regeneración del epitelio (n). La capa de células basales muestra cambios restaurativos, evidenciados por una vacuolización significativamente menor (o). Sin embargo, la hinchazón y el edema en las fibras de colágeno (p) todavía se pueden observar en niveles bajos.

La piel es el órgano más grande y esencial de nuestro cuerpo, que es una capa defensiva externa. El daño a la piel afecta las diversas funciones y compromete la capacidad de trabajo y la independencia del paciente. Una lesión por quemadura es una experiencia traumática y, según la gravedad de la herida, la cicatrización lenta, la infección, el dolor y la cicatrización hipertrófica siguen siendo un desafío importante en la investigación y el tratamiento de las quemaduras63. Una herida por quemadura experimenta una alta permeabilidad capilar debido a la exposición directa al calor, lo que hace que el plasma se filtre hacia el lugar intersticial desde los capilares. Durante una condición de quemadura, un aumento de la fuga de plasma y la permeabilidad capilar persisten hasta las 48 h y son máximos en las 8 h iniciales. Las heridas por quemadura son sensibles y el paciente experimenta dolor dependiendo de la gravedad de la herida. El advenimiento de la fuga de plasma y la permeabilidad capilar generalizada es un fenómeno específico de las heridas por quemadura64. La investigación actual se centra en vendajes suaves para heridas que son pegajosos debido a la propiedad bioinspirada de la polidopamina. Dicho vendaje suave para heridas puede ser beneficioso para tratar heridas por quemaduras, ya que la pegajosidad del hidrogel no es extremadamente adhesiva ni resistente. Para muchos selladores a base de gelatina comercializados, los adhesivos tisulares pueden ser beneficiosos para la reparación de tejidos1,8,18. Tales lesiones tisulares requieren atención inmediata para restaurar la funcionalidad estándar del órgano. En lesiones mayores asociadas con traumatismos o cirugías, se espera que los adhesivos tisulares sean fuertes, robustos, elásticos, no tóxicos y realicen diversas adherencias superficiales8.

La mezcla de hidrogel preparada por el método de colada en solución era translúcida y no mostraba propiedades pegajosas (Fig. 8a). La mezcla de PVA-almidón y reticulado con GA sirvió como base para incorporar aún más la propiedad pegajosa. La reciente investigación bioinspirada tiende a modificar las propiedades poliméricas de los hidrogeles2,18. La práctica de utilizar dopamina polimerizada alcalina65 para inducir diversas propiedades adhesivas superficiales en un sistema de hidrogel de poliacrilamida y bis-acrilamida se ha informado anteriormente4, aunque varios investigadores han establecido su efecto cancerígeno66. La presente investigación tiene como objetivo una composición altamente biocompatible y un hidrogel bioinspirado rentable que pueda adherirse a diversas superficies utilizando dopamina polimerizada alcalina. Las estimaciones de propiedades físicas de GbH mostraron una buena propiedad de hinchamiento en diferentes solventes que imitaban la condición fisiológica de la herida (Fig. 8a). Los hidrogeles a base de polielectrolitos, debido a la repulsión de carga en las cadenas poliméricas, resultan beneficiosos para lograr la liberación controlada del fármaco29,30. Las heridas por quemadura exhiben una pérdida de líquido más significativa de 5000 g/m-2/d-1 en comparación con las heridas normales. La composición actual de GbH reporta valores bajos de WVT y altos de MRC y es comparable al control31. Los parámetros esenciales del porcentaje de hinchazón WVT, MRC y GF permiten la absorción de exudado y reducen la transferencia de agua de la herida. Por lo tanto, se garantiza una condición para la cicatrización eficaz de heridas al proporcionar una difusión adecuada del fármaco.

Aspectos destacados de GbH en la investigación actual: (a) Desarrollo de hidrogel pegajoso de superficie diversa a base de gelatina bioinspirada para el cuidado de heridas por quemaduras de segundo grado; (b) Esquema de la interacción superficial del grupo catecol con el área de la herida por quemadura; (c) interacción del parche para heridas blandas con el tejido de la herida; parche suave para heridas; (d) QH colocado en herida por quemadura de segundo grado; (e) Reparación de heridas observable el día 3 (flecha) del vendaje y (f) Absorción de exudados: un sello distintivo del hidrogel ideal.

El apósito dérmico para heridas in vivo, el GbH (Tabla 11) demostró una regeneración acelerada del tejido de la piel. El GbH podría eliminarse fácilmente sin dejar ningún residuo o dolor en el modelo de rata. El pegajoso GbH confirma su rendimiento superficial diverso. El grupo catecol libre de la polidopamina interactúa con los grupos amino de la superficie del tejido (Fig. 8b)25. La cicatrización de heridas por quemadura se mantuvo constante en el grupo de control desde el día 1 hasta el día 7. Por otro lado, la escala de cicatrización prevaleció en la mayoría de los grupos tratados con heridas por quemadura a partir del día 3. El análisis histopatológico de casi todos los grupos de tratamiento mostró cicatrización. de heridas por quemaduras, pero el QH demostró un proceso de cicatrización mejor y más rápido que el grupo de tratamiento con formulación en crema y fue similar al grupo tratado con SS. Las formulaciones de GbH tienen una ventaja sobre las formulaciones en crema ya que las primeras pueden ser reemplazadas por nuevas formulaciones cada tercer día, mientras que la formulación en crema debe aplicarse diariamente. El GbH como un vendaje suave para heridas (Fig. 8c) no fue doloroso para las ratas y no hubo enrojecimiento significativo ni cambio en la rutina dietética de las ratas debido a la inflicción de una herida por quemadura de segundo grado o vendaje de GbH (Fig. 8d).

Un hallazgo notable de la presente investigación es el desarrollo de células rosadas y frescas (Fig. 8e) a lo largo del límite de la herida el día 3 con el tratamiento con GbH suplementado con quercetina (grupo QH), que no fue el caso con ningún otro grupo tratado. Un hallazgo reciente de la dosificación de quercetina en la promoción de la cicatrización de heridas favoreció una inhibición de la proteína quinasa activada por mitógeno y la activación de NF-κB en el ensayo de raspado celular in vitro, lo que condujo a la cicatrización de las lesiones por presión52. De manera similar, el grupo placebo también confirmó el efecto significativo de la GbH cargada con quercetina en la cicatrización de la herida por quemadura de segundo grado en el presente trabajo de investigación. Informes anteriores sobre un análisis de liposomas cargados de quercetina desarrollados en diferentes cantidades de carbopol y gelatina condujeron a una curación acelerada de la lesión, lo que redujo sustancialmente el tiempo de cierre de la herida53. Numerosos investigadores han desarrollado la quercetina como fármaco modelo para promover la cicatrización de heridas54,55. Del mismo modo, la investigación actual también enfatiza el impacto positivo de la GbH suplementada con quercetina en la curación de heridas por quemaduras de segundo grado en modelos de ratas. Con el fin de promover la cicatrización de las heridas, las propiedades del hidrogel para absorber exudados y mantener un ambiente de curación limpio y húmedo (Fig. 8f) fueron algunos de los aspectos destacados de GbH en la presente investigación.

Es fundamental considerar que la cicatrización de heridas es un proceso complejo que involucra varios factores, como un ambiente húmedo y cálido. Por lo tanto, como se centra en la 'teoría de la curación de heridas húmedas', una condición de curación húmeda es ideal para el desarrollo del tejido de granulación y fomenta la separación de las células dérmicas. La formulación de GbH reconoce estos elementos cruciales y facilita la cicatrización rápida de heridas al absorber el exceso de exudados y permitir el intercambio de oxígeno y vapor de agua. También protege contra las invasiones microbianas. El GbH, formulado en la presente investigación, es no tóxico, no alergénico, conveniente y rentable. Tiene una función de administración controlada de fármacos y propiedades que le permiten adherirse a diferentes superficies, como implantes médicos y superficies de heridas húmedas o secas. El GbH se puede usar como un parche antiinfeccioso preventivo para controlar infecciones bacterianas o fúngicas en la piel. El GbH desarrollado se validó como un material de apósito ideal para heridas por quemaduras parciales de segundo grado en modelos de ratas. Los hallazgos anteriores culminan en el hecho de que la formulación bioinspirada de GbH puede mejorar la cicatrización de heridas y la reparación de la piel de quemaduras de segundo grado en modelos de ratas, lo que valida su uso preclínico.

Una descripción detallada de los materiales y métodos está disponible en SI Materials and Methods.

El experimento se llevó a cabo en el Instituto de Investigación Industrial y Toxicología, F-209, UPSIDC, MG road, Ghaziabad-201302, India y el experimento fue etiquetado como Proyecto No.: 202112-25; Informe No: IIRT/TOX/202112/ADT/0112; Fecha: 14–12-2021. Todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y reglamentos del Comité con el Propósito de Control y Supervisión de Experimentos con Animales (CPCSEA), Nueva Delhi, India. Los métodos implementados en el estudio actual están de acuerdo con las Directrices ARRIVE 2.067. En SI Materials and Methods se menciona un protocolo que detalla los estudios de toxicidad dérmica aguda, los grupos de tratamiento y el diseño del experimento. El protocolo para el estudio de toxicidad dérmica fue de 14 días y los animales fueron sacrificados por sobredosis de isoflurano utilizando un sistema de anestesia para animales pequeños.

Se obtuvieron ratas (de cualquier sexo), que pesaban entre 250 y 300 g, de la Instalación de Casa de Pequeños Animales Libre de Enfermedades (DFSAH) de la Universidad de Ciencias Veterinarias y Animales (LUVAS) Lala Lajpat Rai, Hisar, Haryana, India. Todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y reglamentos del Comité con el Propósito de Control y Supervisión de Experimentos con Animales (CPCSEA), Nueva Delhi, India. Los métodos implementados en el estudio actual están de acuerdo con las Directrices ARRIVE 2.067. Los animales se pusieron en cuarentena y se alojaron en la Instalación Central Animal House (Registro CPCSEA nº 1753 Wistar /PO/E/S/14/CPCSEA) para su aclimatación durante siete días antes de la experimentación. Los animales de experimentación se dividieron en siete grupos (n = 6) y la duración del protocolo fue de 21 días. Después de 21 días, los animales fueron sacrificados por sobredosis de isoflurano usando un sistema de anestesia para animales pequeños. En SI Materials and Methods se menciona un protocolo que detalla la inducción de lesiones por quemaduras de segundo grado, los grupos de tratamiento y el diseño del experimento.

Los animales fueron anestesiados y sacrificados por decapitación, y las muestras de tejido de piel fueron recolectadas y procesadas de acuerdo con los protocolos estándar. Las muestras utilizadas para la observación histológica se depositaron en formalina tamponada neutra al 10%. Los criterios farmacológicos constructivos, incluido el tiempo de epitelización y contracción de la herida, han sido monitoreados por protocolos regulares68. La calidad de la piel curada por quemaduras, en comparación con un grupo normal, se evaluó utilizando una máquina de estiramiento de heridas, EFG500E, medidor de fuerza digital EFGE. Los estudios histológicos comenzaron inmediatamente el día 21, justo después de la inducción de la lesión por quemadura.

Después de la decapitación el día 21, se eliminó con cuidado todo el espesor de la piel curada y natural (1 cm2). El tejido se pesó y luego se homogeneizó con un homogeneizador de vidrio a 4 °C en 1 × PBS (peso del tejido (g): PBS (mL) volumen = 1:9) y luego se centrifugó a 10 000 g a 4 °C durante 30 min. . Los parámetros bioquímicos incluyen los niveles de malondialdehído (MDA)69, glutatión (GSH)70 y (catalasa) CAT71 de la muestra de piel homogeneizada, de acuerdo con los protocolos estándar, que se analizaron utilizando un espectrofotómetro de doble haz UV/Visible (Shimadzu) y se expresaron en nmoles. MDA/ml, μ-mol/g tejido y µmoles de peróxido de hidrógeno utilizados/mg/tejido/min, respectivamente.

El hidrolizado del tejido de la piel se preparó de acuerdo con el protocolo mencionado anteriormente del día 2172. Los contenidos de hidroxiprolina (HXP) y hexosamina (HXA) de los tejidos granulados se estimaron utilizando un espectrofotómetro de doble haz UV/Visible, Shimadzu, de acuerdo con los protocolos mencionados anteriormente y expresado en μg/mg de tejido.

El factor nuclear kappa B (NF-κB) de la muestra de piel homogeneizada se midió sobre la base de la teoría Sandwich-ELISA usando el paquete Rat NF-ŚB ELISA (Biolab Technology Laboratory, Shanghai Korian Biotech Co., Ltd). La muestra se preparó siguiendo el protocolo del operador y se midió a 450 nm en 10 min utilizando un lector de microplacas (Alere AM 2100).

Se sacrificó una rata de cada grupo el día 21 después de la herida para el examen histopatológico. Se extirparon muestras de tejido (2 × 3 mm) colocadas en formalina tamponada (10 %), deshidratadas con alcohol, y finalmente se insertaron en bloques de cera de parafina. Para la evaluación de las modificaciones patológicas, se tiñeron trozos delgados de muestras de tejido (5 μm) con hematoxilina y eosina (H y E)73. Los portaobjetos teñidos se estudiaron con un microscopio Olympus CX41, Olympus Life Science Solutions, utilizando el software Magnus Pro Image Analysis. Se investigaron los portaobjetos para determinar congestión, degeneración y necrosis, neovascularización, proliferación y epitelización de fibroblastos, edema e infiltración de leucocitos. Todos los resultados estadísticos se analizaron mediante un método ANOVA de dos vías seguido de un análisis post-hoc de Tukey con p ≤ 0,05 considerado significativo para todos los valores en GraphPad Prism 8.4.3.686.

El protocolo de investigación para la toxicidad dérmica aguda del hidrogel adhesivo a base de gelatina bioinspirado en ratas albinas Wistar según las pautas regulatorias de "OCDE 402" para la prueba de productos químicos se llevó a cabo en el Instituto de Investigación Industrial y Toxicología, Ghaziabad, India, Proyecto No. .: 202112-25; Informe No.: IIRT/TOX/202112/ADT/0112.

El protocolo de investigación para la curación de heridas por quemaduras de segundo grado fue aprobado por el Comité Institucional de Ética Animal (IAEC) de Khalsa College of Pharmacy, Amritsar, Punjab. ver aprobación no. AICE/KCP/2020/008.

Suchithra TV, Benu G, Hidrogel adhesivo a base de gelatina como parche para curar heridas en diversas superficies. (Solicitud n.º: 202041044794, oficina de patentes del Gobierno de la India, estado: archivado).

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado.

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Descargar referencias

Nos gustaría agradecer a Animal House Facility, Khalsa College of Pharmacy, Amritsar, India, quienes nos abrieron sus puertas para un estudio colaborativo con la Escuela de Biotecnología, Instituto Nacional de Tecnología de Calicut, Kozhikode, India. Un agradecimiento especial al Dr. Madhukar Saxena, Babasaheb Bhimrao Ambedkar University Lucknow, por todo el apoyo durante la etapa final. También nos gustaría agradecer a la Dra. Anugya Bhatt y su equipo por permitirnos realizar la optimización de la toxicidad del hidrogel.

Escuela de Biotecnología, Instituto Nacional de Tecnología Calicut, Kozhikode, India

Benu George & Suchitra TV

Departamento de Farmacología, Khalsa College of Pharmacy, Amritsar, Punjab, India

Nitish Bhatia y Abhitinder Kumar

Facultad de Medicina y Ciencias Afines, Universidad GD Goenka, Haryana, India

Nitish Bhatia

CSIR-Instituto Central de Investigación del Cuero, Adyar, Chennai, India

Gnanamani A., Thilagam R. y Shanuja SK

División de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Zoología, Universidad de Calicut, Kozhikode, India

Kannan Vadakkadath Meethal y Shiji TM

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BG: Conceptualización, Validación, Metodología, Investigación, Análisis formal, Redacción—borrador original; STV: Metodología, Validación, Supervisión, Redacción—revisión y edición; NB y AK: Metodología, Recursos, Análisis formal, Edición; GRT y SKS: Recursos, Edición; KVM y STM: Metodología, Recursos, Edición.

Correspondencia a Suchithra TV.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

George, B., Bhatia, N., Kumar, A. et al. Hidrogel pegajoso a base de gelatina bioinspirada para diversas superficies en el cuidado de heridas por quemaduras. Informe científico 12, 13735 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17054-w

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Recibido: 12 Abril 2022

Aceptado: 20 de julio de 2022

Publicado: 12 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17054-w

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